实验室PCR反应的污染源追踪及控制措施策略

498 人阅读发布时间：2024-05-14 10:39

PCR技术是一种体外模拟DNA复制过程的核酸扩增技术，主要通过重复高温变性、低温退火和延伸三个循环，然后将靶DNA扩增数百万倍，因此PCR技术的优势就是极高的灵敏度，但是任何事物都有其两面性，PCR技术最大的一个缺点就是—易污染，极其微量的污染都有可能导致假阳性的产生。一旦发生实验室核酸污染，正常开展的实验就必须要停止，然后花费大量物力、人力直到寻找污染源，或者实验室清洁达标为止，而且实验报告结果必须作废，需重新实验，结果才可靠。为了有效的避免污染，获得稳定可靠的检验结果，我们在实际的工作当中往往需要采用一定的措施来预防或者消除污染。
一、污染的来源：
1、试剂污染
由于在PCR试剂配制过程中，由于加样器、容器、水及其他溶液被核酸污染。
2、设备污染
半自动核酸提取仪、全自动核酸提取仪在提取过程导致溅洒样本或者核酸模板，污染机器。或者设备内垃圾筒清洁不彻底，残留液体或结晶挥发形成气溶胶对造成污染。
3、标本交叉污染
可能是由于收集标本的容器被污染，标本放置时由于密封不严溢于容器外，容器外黏有标本，吸样器污染及空气中的气溶胶导致的标本间交叉污染。尤其是病毒类可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
4、PCR扩增产物污染
这是PCR中最常见的污染问题，常见于需要在扩增后开盖的检测项目，或者是扩增后产物处理不当，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染就可形成假阳性。
5、克隆质粒的污染
在实验室操作中经常会用到阳性参考品，这些阳性参考品大多数是由某些用克隆质粒制作而成，克隆质粒在单位容积内浓度高，不小心使用极易造成污染。
有些实验室自己克隆质粒做质控品，配制过程后，垃圾的处理方式不严格等，从而造成质控品对实验室的污染进而造成实验室对标本的污染。

二、控制污染的措施：
1、实验分区域
合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意标本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。
最好能划分：标本处理区，PCR反应液制备区，PCR循环扩增区，PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用。
实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或RNA.
2、各区物品不得混用
各个实验区域要对不同设备、物品颜色有明显的标记，如各区域使用专门的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、笔等，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
使用一次性用具吸头、离心管、无粉尘手套、口罩等
3、设置规范的空调通风系统
尽可能采用全送全排空调系统。在进入各个操作区域需要严格单一向进行，即试剂准备和贮存区→样品制备区→ＰＣＲ扩增区→扩增产物分析区，不得逆行。
4、污染监测
设立阳性对照、阴性对照，进行重复试验，选择不相同区域的引物进行ＰＣＲ扩增等，做好污染监测，以便采取措施防止和消除污染。
5、定期实验室清洁
配制含有效氯 0.5% 的消毒液对设备表面、台面、地面、物品表面、传递窗内及门窗进行擦拭，对设备内垃圾桶进行浸泡。
根据从上到下、从里到外的原则进行酒精对空喷洒。
酒精擦拭（75%）移液器、八连管离心机、混匀振荡器等小型设备。
纯化水对设备表面、台面、地面进行擦拭，对设备垃圾桶进行冲洗。

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