荧光定量PCR（Rt-PCR）反应基本原理

297 人阅读发布时间：2025-07-21 16:05

荧光定量PCR（Real-time PCR）是一种通过实时监测荧光信号来定量分析DNA或RNA的技术。荧光定量PCR技术因其高灵敏度、高特异性和快速定量的特点。通过在PCR扩增反应体系中加入荧光基团来实现对核酸分子的定量检测。其基本原理如下：

1. 反应体系：在PCR反应中，除了传统的模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液外，还需要荧光基团。根据使用的荧光化学物质不同，荧光定量PCR主要分为两类：荧光染料法和荧光探针法。
2. 荧光染料法：以SYBR Green I为代表，这种染料能与双链DNA特异性结合，游离时几乎无荧光，但与DNA结合后荧光大大增强。因此，随着PCR产物的增加，染料结合量增加，荧光信号增强，可以监测任何双链DNA的扩增。然而，该方法无法区分特异性与非特异性产物。
3. 荧光探针法：以TaqMan探针为代表，探针两端分别标记报告荧光基团和淬灭基团。在扩增过程中，探针与目标序列杂交，Taq酶的5'外切酶活性会降解探针，使荧光基团和淬灭基团分离，荧光信号增强，仅当目标序列扩增时产生荧光，提高了特异性。
4. 实时监测：荧光定量PCR在每一个PCR循环后都实时检测荧光信号，不需要在反应结束后进行额外的电泳或染色步骤。荧光信号的变化反映了PCR产物的累积情况。
5. 数据解读：通过荧光信号的累积，可以绘制出扩增曲线，包括基线期、指数期和平台期。指数期的荧光信号呈指数增长，与模板量呈线性关系。设定荧光阈值后，可以确定每个反应管的CT值（循环阈值），CT值与起始模板量的对数成线性关系，从而实现定量分析。
6. 定量分析：利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，未知样品的CT值可以通过标准曲线计算出起始拷贝数。这种方法既可用于绝对定量（直接计算拷贝数），也可用于相对定量（比较不同样本间的相对表达量）。
7. 优势：荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、无污染、自动化程度高、结果可靠等优点，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域。

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