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上海抚生实业有限公司
入驻年限：7 年
- 联系人：
刘小姐
- 所在地区：
上海
- 业务范围：
细胞库 / 细胞培养、试剂、实验室仪器 / 设备、技术服务、耗材
- 经营模式：
生产厂商 经销商 代理商
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分享荧光定量PCR相关要点合集
人阅读 发布时间：2021-12-21 11:59
荧光定量PCR简介 ，荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量 PCR技术服务。
荧光定量PCR原理 ：
荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：
1、荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。
2、在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起3、始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值。
荧光定量检测 ：
荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。
嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ） ：
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合
双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。
荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示
荧光定量PCR的应用
一、分子生物学研究 ：
1、核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。
2、基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证
3、SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。
4、甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。
二、医学研究 ：
5、产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
6、病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
7、药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。
8、肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
荧光定量PCR实验常见问题解答：
一、没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况，排查是否有以下问题：
1、循环数不够（一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）；
2、PCR程序设置错误，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；
4、模板量可能降解或上样量不足（不超过500ng，根据试剂盒说明书即可），对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融；
5、引物探针是否合适（尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增）。
二、标准曲线不佳
标准曲线线性关系不佳R2<0.9），很有可能是以下环节存在问题：
1、标准品稀释或者加样误差，使得标准品不呈梯度；
2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，现配现用；
3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；
4、模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以50—500ng为宜。
三、ct值过晚
在相对定量中，Ct值一般控制在15—25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。
1、 扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适，需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；
2、PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的时间条件下延长10s）；
3、MgCl2 浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
四、熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题：
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳，尤其是涉及二聚体存在时，适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比例；
2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒，不同试剂盒在该方面的优化能力不适合，有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果；
五、阴性对照扩增有信号
照扩增有信号排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。
4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
六、扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常，比如“S"型曲线等等情况，有可能是以下环节存在问题：
1、模板的浓度太高或者降解；
2、荧光染料的降解；
3、在操作荧光定量PCR时，带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等；
4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发，没有很好的聚集在管子里；
5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
七、扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时，应考虑如下情况：
1、反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解；
2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法，适当延长变性退火时间；
3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的，应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。
荧光定量PCR原理 ：
荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：
1、荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。
2、在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起3、始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值。
荧光定量检测 ：
荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。
嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ） ：
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合
双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。
荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示
荧光定量PCR的应用
一、分子生物学研究 ：
1、核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。
2、基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证
3、SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。
4、甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。
二、医学研究 ：
5、产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
6、病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
7、药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。
8、肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
荧光定量PCR实验常见问题解答：
一、没有ct值
检测结果遇到没有Ct值情况，排查是否有以下问题：
1、循环数不够（一般不超过45循环，不仅背景值提高，定量也不准）；
2、PCR程序设置错误，检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中；
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解；
4、模板量可能降解或上样量不足（不超过500ng，根据试剂盒说明书即可），对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起；如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融；
5、引物探针是否合适（尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增）。
二、标准曲线不佳
标准曲线线性关系不佳R2<0.9），很有可能是以下环节存在问题：
1、标准品稀释或者加样误差，使得标准品不呈梯度；
2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装，保存于-20℃或-80℃，现配现用；
3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针；
4、模板中存在抑制物。模板浓度过高，根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以50—500ng为宜。
三、ct值过晚
在相对定量中，Ct值一般控制在15—25之间比较好，如果在绝对定量中，对低拷贝数的样品，Ct值会增大，但是一般不宜超过40循环，否则定量不准确。因此，判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况，需要根据具体实验设计和目的进行。
1、 扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适，需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；
2、PCR程序不合适，改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短（可以在推荐的时间条件下延长10s）；
3、MgCl2 浓度不合适，增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足；
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp；
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
四、熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题：
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳，尤其是涉及二聚体存在时，适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比例；
2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒，不同试剂盒在该方面的优化能力不适合，有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果；
五、阴性对照扩增有信号
照扩增有信号排查各操作环节是否有不当，造成交叉污染：
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。
4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增。
5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染，建议对操作环境进行处理，或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
六、扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常，比如“S"型曲线等等情况，有可能是以下环节存在问题：
1、模板的浓度太高或者降解；
2、荧光染料的降解；
3、在操作荧光定量PCR时，带上新的一次性手套，盖上避免任何指纹或者字迹等；
4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发，没有很好的聚集在管子里；
5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
七、扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因，特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时，应考虑如下情况：
1、反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解；
2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法，适当延长变性退火时间；
3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的，应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。
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