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小鼠Elisa试剂盒实验步骤的要求

发布时间:2020-09-17 16:40 |  点击次数:

小鼠Elisa试剂盒  样本处理及要求:
   
1.
血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

   
2.
血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

   
3.
细胞培养物上清或其它生物标本:1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

   
注:标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

 
小鼠Elisa试剂盒  操作程序:

1. 弃去液体,甩干,每孔加满稀释后洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。如此重复5次,拍干。
   
2.
每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。。

   
3.
取出酶标板,每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

   
4.
测定:以空白孔调零,在450nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

   
5.
根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的,其实际浓度应该乘以总稀释倍数。

小鼠Elisa试剂盒 实验步骤:
 
1.用盐和/或PEG沉淀血浆中C5:在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100gL,然后加人100/uL沉淀剂,用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。

① 在微量反应板中加入100uL 2mol/L HCl与100uL EDTA抗凝血浆混合,室温5h。加入HCl后血浆pH值在1.0-1.5之间。上清用4倍体积的0.29mol/L Tris调节至pH7.1-7.4。
②在微量反应板中加入100uL沉淀剂①,室温30min。
③ 在微量反应板中加入100uL沉淀剂②(血浆pH值在4.0-4.5之间)。室温30min。用方法2)和方法3)沉淀C5后,上清加入4倍体积的含0.05%Tween 20 pH7,10.21mol/L Tris-HCl缓冲液,血浆被稀释10倍。

2.用抗C单克隆抗体(McAb)包被酶标反应板:用pHl0.6,50mmol/L碳酸钠溶液将抗CMcAb稀释成10ug/mL,每孔加100uL,4℃ 16h。次日取出每孔加含1%(W/V)明胶的PBSl50gL,室温lmin;然后用PBS-Tween 20洗涤一次。

3.样本中CSa的检测:

洗涤后的酶标板,每孔加入方法1)、2)或3)处理的血浆样本zoot&,4℃16h,用PBS-Tween20洗涤1次,每孔加入用含0.1%明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC.多克隆抗体(46ug/mL)100t&,室温2h,用PBS-Tween20洗涤3次;每孔加入用含0.1%明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&(稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100ul无关鼠McAb、10ul人血浆或10ul激活的人血清处理),室温2min,每孔用PBS-Tween20洗涤4次;每孔加入底物溶液100ul,lmin后以PBS-T调零,每3min于酶标仪405nm处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C含量呈正相关。本法zui低检测极限为1ng/mL,此法未检测出正常人新鲜血浆中的C。

4. 标准曲线的绘制:取已知浓度纯化的C,对倍稀释成一系列不同的浓度(0.039-5.000ng/mL),分别加入包被有抗CMcAb的酶标板中,然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物,以PBS-Tween调零点,读取OD40s/min增加量,以C(desarg)浓度为横坐标,OD40s/minx 200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C。