巢式PCR中引物浓度的优化方法

在巢式PCR中，优化引物浓度是提升特异性和效率的关键。核心原则是：‌外引物浓度较低（0.1-1 μM），内引物浓度显著更高（可达外引物的40倍以上）‌，以实现两轮扩增的高效衔接。

优化策略与原理

浓度梯度设计‌：外引物浓度较低，可减少非特异性扩增；内引物浓度高，能有效结合第一轮产物，驱动第二轮高效扩增。

退火温度配合‌：第一轮使用较高退火温度（基于外引物Tm），第二轮降低温度（基于内引物Tm），高浓度内引物有助于低温下特异性结合。

避免非特异性扩增‌：外引物浓度过高易产生非特异性产物，内引物浓度过低则第二轮效率低下。

操作建议

浓度范围‌：外引物通常为0.1–1 μM，内引物可设为40–100 μM或更高。

系统优化‌：通过梯度浓度实验（如外引物0.1/0.5/1 μM，内引物相应倍数）确定最佳组合。

对照设置‌：每轮设置无模板对照（NTC），监控污染或非特异性扩增。

遵循"外低内高"原则，结合退火温度优化，可显著提升巢式PCR成功率。