PCR（聚合酶链式反应）扩增假阳性现象预防处理

274 人阅读发布时间：2025-06-17 15:10

PCR（聚合酶链式反应）是一种用于在体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其基本原理是通过模拟生物体内DNA的复制过程，利用高温变性、低温退火和中温延伸三个步骤的循环来实现DNA的指数级扩增。
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PCR扩增假阳性是指在PCR（聚合酶链反应）检测过程中，即使样本中没有目标核酸序列，也出现了阳性结果的现象。这种情况可能会导致错误的诊断或结论。假阳性的原因多种多样，主要包括：
1. 引物非特异性扩增：引物可能与非目标序列发生扩增，形成引物二聚体或与其它序列的同源区域发生非特异性结合，导致假阳性。
2. 污染：

气溶胶污染：操作过程中产生的气溶胶可能携带阳性核酸片段，污染试剂或样本，导致假阳性。
试剂污染：PCR试剂在制备过程中可能被阳性核酸污染。
环境和耗材污染：实验室环境、操作台面、移液器等可能被阳性核酸污染。
交叉污染：不同样本之间的交叉污染，尤其是在开放或不规范的操作环境中。

3. 引物设计问题：引物设计不合理，可能与非目标序列有同源性，导致非特异性扩增。
4. 样本问题：样本中可能含有与目标序列相似的核酸序列，导致非特异性扩增。
5. 实验室条件：不合理的实验室建设，如缺乏正负压系统，或分区不足，可能导致核酸气溶胶污染。
6. 操作失误：如使用不配套的反应管与盖子，导致反应液蒸发，影响荧光读取，进而产生假阳性。
7. PCR扩增产物污染：前次扩增的产物可能污染试剂或后续样本，导致假阳性。
8. 酶和引物过量：在没有模板的情况下，过量的酶和引物可能导致假阳性。
9. 环境温度和湿度：不适宜的环境条件可能影响PCR反应的特异性。

预防和处理假阳性:

严格分区操作：确保实验室有标准的四分区（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区），减少交叉污染。
正压系统：使用正压系统，防止气溶胶污染。
一次性耗材：使用一次性吸头、PCR管，减少交叉污染。
无菌操作：在无菌环境下操作，佩戴一次性手套。
分装试剂：多次使用的试剂应分装，减少污染风险。
阴性对照和阳性对照：设置阴性对照（无模板）和阳性对照（已知阳性样本），以监控实验的特异性和污染情况。
验证引物特异性：通过溶解曲线或测序验证引物的特异性。
实验室清洁和维护：定期清洁实验室，维护设备，减少环境和耗材污染。
操作规程：严格遵守PCR操作规程，避免操作失误。
污染控制：一旦发现假阳性，应立即停用可能被污染的试剂，重新配置，并彻底清洁实验室。

通过上述措施，可以有效预防和减少PCR扩增假阳性的发生。

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