贴壁细胞及悬浮细胞冻存操作步骤

  细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则，慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。

一、原理

当温度低至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止，低于-130℃时，细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。

冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1、预热冻存液；

2、用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化（此步骤同细胞传代操作）；

3、终止消化后，重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5min；

4、弃上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5、分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

6、将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

7、将冻存管转移至液氮长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1、用移液管将细胞悬液吹吸均匀，将细胞悬液移入离心管；

2、1000rpm离心 3 min，收集细胞沉淀；

3、用预热的冻存液重悬细胞，细胞冻存最佳密度为3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4、分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；

5、将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

6、将冻存管转移至液氮长期保存。

       贴壁细胞冻存操作示意图

注意事项：

①、细胞培养、传代以及冻存需要严格的无菌操作。

②、传代时需要适度的消化，消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

③、传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。

④、细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中。

⑤、应选择汇合度80%-90%左右，并且活力达90%以上处于对数生长期时的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整。

⑥、程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都要复温至室温备用。

⑦、冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。

⑧、冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

⑨、细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，放置时间不要超过3天。

⑩、液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。