细胞培养技术必看干货分享

    细胞培养是指细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。通过细胞培养我们可以获得大量的、性状相同的细胞，以便于研究细胞的形态结构、化学组成及功能和机制。

一、细胞培养的5大基本条件：

1.合适的细胞培养基

培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，分为天然培养基和合成培养基。现在实验室一般都用的是合成培养基，合成培养基现已有DMEM,1640，IMDM,L15等，不同的细胞来使用不同种类的培养基，比如贴壁细胞大多都可以用DMEM来培养，悬浮细胞则大多用1640培养。

2.血清的品质

人工合成的培养基只能维持细胞生存，要想细胞生长和繁殖，还需补充优质血清来增加养分。血清是培养基里最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及营养成分。

3.无菌无毒的细胞培养环境

培养环境无菌无毒是保证培养细胞生存的首要条件。人体内有强大的免疫系统和解毒器官，所以当有毒物质侵入体内时，免疫系统和肝脏等器官可以对他们进行抵抗和清除。但是细胞在体外培养就失去了抵抗能力，一旦被污染细胞就会死亡，所以保持无菌无毒的环境是体外培养细胞最基本的条件。

4.恒定的细胞生长温度

要维持细胞增殖和生长，要有合适的温度。目前大部分实验室培养的细胞主要都是人、大鼠、小鼠、猪等哺乳动物的细胞，一般的细胞培养温度都是在37℃左右，在这种温度下细胞才可以生长和正常代谢。温度偏高时，高于39℃或者更高会对细胞造成损伤甚至是死亡；温度偏低时，不低于0℃虽然会影响细胞代谢和生长状态，但是不会使细胞死亡，恢复温度后大部分细胞都可以恢复生长特性。极少数实验室有昆虫细胞比如SF9、hi-five等需要在28℃的环境培养，具体培养温度一定要关注细胞库及相应说明书信息。

5.合适的气体环境

合适的气体环境也是细胞生存的条件之一，所需要的气体有O₂和CO₂。O₂产生能量使细胞生长增殖和合成各种所需成分，CO₂是细胞代谢物也是细胞所需要的成分，它的主要作用是维持培养基的pH。大部分培养基都是把细胞放置于95%的空气和5%的CO₂的混合气体中，但L15培养基作为单独设计的培养体系，需要直接在100%空气条件下培养细胞，若通入5%二氧化碳则会导致培养基pH偏酸性从而使细胞状态变差或者死亡。

二、细胞培养环境：

不同的细胞，培养环境是不同的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞，比如：内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，例如：巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度快，贴壁速度也快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以进行细胞培养的时候应该多探索该细胞喜欢的生长空间密度和生长规律等相关问题，才能培养出理想的细胞。

三、细胞培养常见问题：

停滞期：细胞适应培养条件的阶段，细胞在此阶段不分裂。细胞通常在起始培养后的24小时内附着，该阶段的总时长取决于培养之初使用细胞的生长阶段和接种密度。

对数期：细胞在此阶段积极分裂，是评估群体生长和通用数据收集的时间。对数期的后期，过度拥挤导致细胞胁迫之前是传代细胞(亚培养)的时机。

平稳期：随着细胞达到融合，细胞在此阶段生长放缓，不足1/10的细胞处于活跃细胞周期。细胞在此阶段最容易受伤，因此需要小心观察以确保细胞在此阶段之前或之初进行传代。

衰退期：细胞周期的自然组成部分。在此阶段，随着细胞死亡占据主导地位，活细胞群体数量减少。

四、细胞培养板的选择：

1）细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U型和V型）；

2）培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；

3）根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。

平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择：

1）贴壁细胞一般用平底培养板。

2）悬浮型细胞的培养一般用V型。

3）U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。

4）V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。