免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。从而进行形态与功能结合的研究，对于病理学领域具有十分重要的意义。

实验步骤 ：

1、切片
将包埋好的组织置于石蜡切片机上进行切片，石蜡切片厚度5 μm，切好的组织置于40℃水中展平，随后用玻片捞出，置于烘箱60℃，烤片30min。
注意：对骨或者皮肤这些易脱片的组织，可适当延长烤片的时间。
2、脱蜡至水
目的：为了脱去组织石蜡，让组织水化，易于孵育。
将玻片连同架子依次放入C₈H₁₀、酒精中进行脱蜡，C₈H₁₀脱蜡三缸，每缸10min。100%，85%，70% 酒精依次浸泡10min。
注意：可根据气温适当延长或缩短时间。
3、抗原修复
目的：使抗原位点暴露出来
材料：柠檬酸缓冲液
清水冲洗玻片，然后连同架子放入柠檬酸缓冲液中，在微波炉中煮沸，然后室温冷却。
4、封闭
目的：封闭非特异性结合位点
材料：免疫组化笔
室温冷却后将柠檬酸倒掉，并在染色缸中用PSB清洗玻片。用免疫组化笔在玻片上画圈防止试剂流出，滴加封闭血清，于恒温箱中37℃孵育30min。
5、一抗二抗孵育
材料：PBS缓冲液
将载玻片取出，倒去血清，滴加一抗，4℃冰箱保存过夜。取出后用PBS清洗玻片。然后同样操作依次滴加二抗、SABC、显色剂、并每次用PBS洗涤玻片。
6、复染
材料：苏木素染色液
取玻片浸泡于苏木素染色液中，一般动物组织染30s，植物组织染3-5min，蒸馏水水洗，1%盐酸酒精中脱色，浸泡水洗。
注意：具体复染时间根据染色效果进行调整。
7、脱水
将复染结束的玻片依次浸泡于70%，85%，100%酒精中梯度脱水，每缸3min；二C6H5CH3三缸，每缸2min。
8、封片
材料：中性树脂
最后中性树脂滴在玻片组织旁进行封片，通风橱晾干，观察实验结果及拍照。

免疫组化操作中常见问题和解决方法汇总：
1、切片染色深
问题原因：一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。
解决方法：是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色。

2、时间过长或温度过高影响实验结果
问题原因：忽视操作规程，没有严格控制时间，因遗忘而造成时间延长或温度过高。
解决方法：实验人员应当严格执行操作规程，随身佩带报时表或报时钟，及时提醒。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

3、DAB显色不理想
问题原因：DAB 变质或显色时间太长。
解决方法：DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。当染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。
配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应，从而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。

4、组织变干
问题原因：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因
解决方法：实验人员在操作过程中要做到仔细认真，并采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。

5、切片背景着色
问题原因：切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时，并切放置在室温下，特别是炎热的夏天，就会出现背景着色。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4oC 冰箱过夜，对结果无明显影响。
解决方法：室温下不可存放时间太长，尤其是夏天。切片和修复液如需过夜，最好存放在 4oC 冰箱内。

6、切片不显色或者背景着色
问题原因：一抗变质、质量差的多克隆抗体，是导致切片不显色或者背景着色的主要原因。
解决方法：一定要注意一抗的有效期，用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

7、非特异性染色
问题原因：忘记血清封闭，在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。
解决方法：封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可与一抗来源相同。

8、操作过程中脱片
（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。
（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。
（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。
（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。
（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。
（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。