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上海抚生实业有限公司
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细胞传代培养步骤及传代密度问题解决方案介绍
人阅读 发布时间：2024-01-15 16:12
因为培养皿的限制，细胞到达一定的密度之后它的生长速度就会放缓，所以为了让细胞保持在对数生长期，保持细胞旺盛的分裂能力。这时候需要进行细胞传代！
细胞培养的雷比较的多，我遇到过比较的情况。这里可以做慢慢的分析和讨论！先把基本的细胞培养的步骤贴出来！需要注意的是，悬浮细胞和贴壁细胞的传代培养是不一样的。
贴壁细胞传代::
1：对于贴壁细胞来说，它需要把上清去掉，用1-2ML的PBS洗一下细胞，然后用枪吸去洗涤液，然后加入胰酶进行细胞消化。（加入1-2ML的PBS， 我是会贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。这一步的目的是为了去掉残余的培养基的，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。此外，常见的是0.25%的胰酶。一般根据细胞皿的大小加入胰酶，对于10cm的dish，我会加入1ml的胰酶。）
2：放到37摄氏度培养箱30s-1min（我这里处理的是293T细胞，不同的细胞的消化时间是不一样的，需要具体的去查一查，如果消化的好的细胞是会呈现流沙状态的，上下晃动都会随着移动的。）
3：加入含有血清的培养液终止消化，用枪把培养液吹匀。（因为含有血清可以终止胰酶的消化反应，用枪吹培养皿底是为了把残留在底部的细胞吹起来）
4：转移到15ml的离心管中，离心，200g 5-10min(一般我是1000rpm离心3min)
5：去掉上清液，然后用PBS 重悬细胞，加入的PBS的量是10ML。再次离心，去掉上清。
6：加入适量的培养基，把细胞重悬，然后转移到培养皿里面。放入到37摄氏度的5%的二氧化碳培养箱。
悬浮细胞传代:
1：对于悬浮细胞，达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。（GM12878非常典型，当然了，有的细胞不会聚集成团，比如说K562）
2：可以用台盼蓝溶液+自动细胞计数器或血细胞计数器，确定细胞的密度，计算需要添加的培养基体积，将培养物稀释至建议的接种密度。
3：一般是按比例稀释一下培养基，然后继续传代。（我在传K562的时候，是会1：4的比例去传代，保证细胞密度在1M/ML以下，能达到对数生长期，细胞处于旺盛的分裂期）
4：把细胞放入到37℃，5%的二氧化碳培养箱中，进行培养
传代问题解决方案:
1.传代密度过高
一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）
解决方案:
尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。
2.传代密度过低
哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
解决方案:
细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度.
细胞培养的雷比较的多，我遇到过比较的情况。这里可以做慢慢的分析和讨论！先把基本的细胞培养的步骤贴出来！需要注意的是，悬浮细胞和贴壁细胞的传代培养是不一样的。
贴壁细胞传代::
1：对于贴壁细胞来说，它需要把上清去掉，用1-2ML的PBS洗一下细胞，然后用枪吸去洗涤液，然后加入胰酶进行细胞消化。（加入1-2ML的PBS， 我是会贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。这一步的目的是为了去掉残余的培养基的，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。此外，常见的是0.25%的胰酶。一般根据细胞皿的大小加入胰酶，对于10cm的dish，我会加入1ml的胰酶。）
2：放到37摄氏度培养箱30s-1min（我这里处理的是293T细胞，不同的细胞的消化时间是不一样的，需要具体的去查一查，如果消化的好的细胞是会呈现流沙状态的，上下晃动都会随着移动的。）
3：加入含有血清的培养液终止消化，用枪把培养液吹匀。（因为含有血清可以终止胰酶的消化反应，用枪吹培养皿底是为了把残留在底部的细胞吹起来）
4：转移到15ml的离心管中，离心，200g 5-10min(一般我是1000rpm离心3min)
5：去掉上清液，然后用PBS 重悬细胞，加入的PBS的量是10ML。再次离心，去掉上清。
6：加入适量的培养基，把细胞重悬，然后转移到培养皿里面。放入到37摄氏度的5%的二氧化碳培养箱。
悬浮细胞传代:
1：对于悬浮细胞，达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。（GM12878非常典型，当然了，有的细胞不会聚集成团，比如说K562）
2：可以用台盼蓝溶液+自动细胞计数器或血细胞计数器，确定细胞的密度，计算需要添加的培养基体积，将培养物稀释至建议的接种密度。
3：一般是按比例稀释一下培养基，然后继续传代。（我在传K562的时候，是会1：4的比例去传代，保证细胞密度在1M/ML以下，能达到对数生长期，细胞处于旺盛的分裂期）
4：把细胞放入到37℃，5%的二氧化碳培养箱中，进行培养
传代问题解决方案:
1.传代密度过高
一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）
解决方案:
尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。
2.传代密度过低
哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
解决方案:
细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度.
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