PCR反应引物退火温度问题分析

       在PCR自动热循环中，关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器 均应进行实测。

      关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物 之间的距离;距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。

1.模板变性温度
     变性温度是决定PCR反应中双链DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不*，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要;反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后高变性温度不宜超过95℃。

2.引物退火温度
     退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

有些是用引物的Tm值－5℃作为退火温度，其实也没必要完全按照这个公式来计算。退火温度跟酶和buffer有关，不同厂家可能不一样。

一般在实验过程中将退火温度设置在55－60℃之间就可以。

没有目的片段可以从以下几个方面考虑:

1. 含有PCR反应抑制物

对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；

2. 模板浓度太低，扩增循环数不够

尽可能降低退火温度，在降落PCR 的最低温度增加10个扩增循环；

3. 非特异扩增

增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR

4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对

改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH

5. 原始模板浓度太低

使用巢式引物对第一次扩增产物进行稀释（l :100 和1:1000)后扩增；

6. 扩增需要增强剂

加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亚枫CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增强剂

7. 引物设计存在问题

重新设计引物