细胞培养的基本步骤与培养细胞被污染清除方法

一、细胞培养的基本原理：
1、细胞传代（生存空间和营养不足，长得太密，代谢废物太多，要洗洗，同时也要分离出一部分细胞，要加入新的培养液）；
2、换液（生存空间和营养剩余，但是代谢废物太多，要洗洗，要吃饭，才能长好，所以要洗和加入新鲜培养基）；
3、冻存（太多了，先存起来，液氮里面里就是低温，保存能量，活得久）；
4、复苏（解冻，恢复吃饭的能力，恢复生长。）这四步。

二、细胞培养的基本步骤（一定要明白每个步骤的意义和目的）：
1、细胞传代（贴壁细胞）：
试剂：PBS,胰酶，含血清的培养基；
流程：显微镜下看一看培养皿里的细胞多不多，太多（80%~90%）会导致代谢废物很多，先吸掉废液，再用PBS洗一洗，同时太多会导致细胞黏在一起，这时候就需要加点胰酶消除它们之间的粘性，是否消除完，在显微镜下看一看，看完加入适宜的含血清的培养基，中和一下胰酶，这叫吹打，除此之外，细胞太多了，把一部分细胞移出来，加入适量的培养基放入孵箱继续培养，这叫传代。
2、细胞换液：
试剂：PBS，含血清的培养基；
流程：先吸掉代谢废物（即细胞瓶中的培养液），再用PBS洗一洗，由于细胞长得不是很多，细胞之间没有黏在一起，因此不需要加入胰酶来消除它们之间的粘性。由于细胞要吃饭，加入新鲜的含血清的培养基，最后放到孵箱里面进行培养。
3、细胞冻存：
试剂：冻存液，PBS，胰酶，含血清的培养基；
流程：要冻存，先配置冻存液，冻存液包含了：DMSO：防止在低温（零度以下至-196℃）保存细胞时，细胞内液会形成冰晶，渗透压会发生改变，细胞结构会出现紊乱，会导致细胞出现损伤。冻存液制备时，一般需与血清一起配置：因为两者互融时，会散发热量，所以冻存液需提前制备。
因为细胞太多了，需要冻存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成细胞悬液，离心，吸掉上清液，加入冻存液，轻轻吹吸均匀，每管等量1ml装入冻存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃过夜，最后放入液氮罐。

4、细胞复苏：
试剂：含血清的培养基；
流程：从液氮中取出冻存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴锅中，解冻时，边晃动边观察，当看到只有一小块冰存在时，即可从水浴锅中取出，打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀，1000r/min,离心五分钟，吸掉上清液，沉淀中加入适量培养液，放入孵箱中，培养。还有就是：复苏的细胞，需要在24小时后，换一次培养液。

三、培养细胞污染清除：
培养细胞一经污染，多数较难处理。在细胞培养中如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再进行细胞培养。污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。
1、用MRA处理
用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好。
2、 用清洗纯化法清除支原体污染的方法
细胞营养驯化→细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤。
其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低限。
如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。
3、药物辅助加温处理
细胞培养先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有**影响。
4、使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。
但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。