探讨免疫荧光实验步骤方法

标记免疫技术发展zui早的一种是免疫荧光，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，接下来的实验方法希望可以帮到您。

1. 细胞固定和通透

为达到蕞佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。步骤很重要，细胞和抗原需要保证蕞佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，

2. 抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。

3. 合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

4. 优化缓冲液和封闭剂

尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。

5. 选择正确的二抗

如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。

6. 使用合适的细胞密度

选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。

7. 多重染色

对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。

8. 降低背景

高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，洗涤液为 PBS+0.05%Tween。

9. 封片

作为免疫荧光的蕞后一步，可以提高折射率，保护样品。

10. 数据分析

观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。