ELISA（酶联免疫吸附试验）操作步骤及常见问题解决

6967 人阅读发布时间：2022-06-24 16:37

ELISA（酶联免疫吸附试验）应用双抗体夹心法测定标本中血清素/血清胺(ST)水平。用纯化的血清素/血清胺(ST)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST)，再与HRP标记的血清素/血清胺(ST)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血清素/血清胺(ST)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中血清素/血清胺(ST)浓度。用到了免疫学原理和化学反应显色，需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原 - 抗体 - 酶 - 底物复合物粘附在载体上，这就是「吸附」的含义。

操作步骤：

标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：操作同3。
洗涤：操作同5。
显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.
终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

ELISA 实验流程图：
新闻图片2

ELISA 常见问题及解决办法：
1. ELISA 试剂盒可以检测哪些类型的标本？
我们的大多数 ELISA 试剂盒均适用于血清，血浆，细胞培养上清液和其它体液。在产品说明书和我们的目录上您会看到具体的适用范围。

2. 样本为什么需要稀释？
1）在一些测试中，样本的读数高于标准曲线，为了得到更加准确的结果，需使分析物的含量在测定范围内，因此需要稀释；
2）以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

3. 背景色过高主要有哪些原因？

原因	解决办法
不正确的洗涤：洗涤不充分或省略洗涤步骤中的任何一步均会导致背景色过高	检查洗涤缓冲液的体积并确保完成所有的洗涤步骤；确保洗涤缓冲液的正确稀释和正确使用
底物污染：在实验时留存一些额外的底物，底物本身不应该有颜色	确保在使用前，底物不被金属离子或氧化剂污染
底物曝光：底物曝光会使底物变成蓝色	在加入板内之前要保存在暗处（即试剂瓶内）
偶合物的错误稀释	偶合物浓度过高会造成高背景色，因此要严格按照产品说明书稀释
孵育时间和温度不对	必须严格按照产品说明书来确定孵育时间和温度

4. 梯度稀释时出现跳孔现象主要有哪些原因？

原因	解决办法
酶标板叠放	避免酶标板叠放
梯度稀释时不准确	确定移液枪精准，梯度稀释正确
蒸发	封闭时加封板膜或盖板
酶标板底部有杂物或水珠	加试剂时确保酶标板底部干净

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