细胞转染方法与影响因素

　   细胞转染是指将外源分子如 DNA RNA 等导入真核细胞的技术。可分为瞬时转染，稳定转染等。

　　瞬时转染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72h内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
　　稳定转染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，通常需要一些选择性标记反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。
 
       主要有下面几种方法：
　　化学法：磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法；
       物理法：电穿孔法、显微注射法、biolistic 颗粒传递法；
       病毒介导法：逆转录病毒、腺病毒。
　　A. 阳离子脂质体法：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。
　　特点：简单通用，适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清，转染效率随细胞类型变化大。由于脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会远大于悬浮细胞，所以贴壁比悬浮转染效率要高。悬浮细胞建议使用电穿孔法。
　　B. 电穿孔法：利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进入的微孔。
　　C. 逆转录病毒(RNA)：通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用进入宿主细胞，之后反转录酶启动合成 DNA 并随机整合到宿主基因组中。
　　特点：稳定转染，可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。
　　D. 腺病毒(双链 DNA)：先和细胞表面的受体结合，继而在αV 整合素介导下被细胞内吞。
　　特点：可用于难转染的细胞。
 
　　影响转染的因素：
　   1、血清
      血清影响复合物的形成，降低转染效率。
　　阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康，对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEM I 培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用 LIPOFECTAMINE 2000。
 
　　2、抗生素
　　比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
 
　　3、细胞代数
　　转染前细胞最好经过 1-2 次传代保证细胞生长旺盛容易转染，注意贴壁细胞一旦长满就不好转染。

　　4、细胞铺板密度
　　一般转染时，贴壁细胞密度为 70%-90%，悬浮细胞密度为 2*10^6--4*10^6 细胞/ml 时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。
 
　　5、DNA 质量
　　DNA 质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果 DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成和转染的进行。