ELISA双抗夹心法检测过程

ELISA双抗夹心法是指将特异性针对待测抗原的抗体包被于 96 孔微孔板 中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中待测抗原与连接于 固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的针对待测抗原的抗体，形成夹心， 将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加 入 TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下 转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测抗原呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(O.D.值)，用于样本中待测抗原浓度测算。根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA双抗体夹心法在应用上最常见。

ELISA双抗夹心法检测过程：

1、抗体包被
在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙xi制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。

2、免疫识别
在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。

3、洗板
将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。

4、酶标信号输出 
加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。