免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry) 是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体 (或抗原) 对组织内抗原 (或抗体) 的分布进行组织和细胞原位检测技术。

一、免疫组化技术的基本原理

应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。

 
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

二、几种常用免疫组织化学方法的原理

1、免疫荧光方法

是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法、ABC 法、SP 法等。

3、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白) 等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。

三、免疫组织化学染色方法
 
1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。

2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中 SP 法是最常用的方法。

四、免疫组化实验流程：

 
免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片（标本制作的 shou 选方法）和冰冻切片。一般而言，石蜡切片要求薄厚均匀，切片完整，且无褶无刀痕，相当考验实验人员的刀工，建议找专业培训过的人员或公司进行切片。

1、脱蜡与水化：将石蜡切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接对着切片冲洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。

2、细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片 30 min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。

3、抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新「满血复活」。

小鱼常用的是微波修复，pH 6.0 的 0.01M 柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复 2 次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。

4、血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用「zhu 传」的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃ 温箱中 30 min, 用滤纸吸去多余的血清。

5、孵育一抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的一抗 20ul，4℃ 过夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 过夜后，需要将切片放置 37℃ 复温 45 min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）

6、孵育二抗：对圈内的组织（面积为 1×1）滴加稀释好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。

7、切片显色：用 DAB-H2O2 显色 10 min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10 min 内即可用蒸馏水终止显色。

8、复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用 Mayer 苏木素染色 30s，水洗，盐酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性树胶封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度）。
 
五、免疫组化技术的优点

1、特异性强 免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

2、敏感性高 在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于 ABC 法或 SP 法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3、定位准确、形态与功能相结合 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。