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ELISA抗原抗体的反应必看

人阅读 发布时间:2022-01-11 11:36

抗体的结构
抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)Ig分五类,即IgGIgAIgMIgDIgE。,这五种抗体的基本结构类型相似,都是由4条多肽链构成,相互之间主要的差异点是重链(因此本小结也是对抗体Fc片段结构的描写)的结构不同,五种抗体亚型的重链对应的分别为γ、μ、α、δ和ε链。与免疫测定有关的Ig主要为 IgGIgMIg由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgGIgM的重链分别称为γ(gamma)链和μ(mu )链。
                   


IgG是人体内最主要的抗体类型,也是目前在功能和结构上,被最为广泛了解的类型。IgG的轻链存在两种形式:kappa (k) lambda (λ). 在人体内,kappa (k)的存在要远远多于ambda (λ)。重链也可以分为不同的亚型:γ1, γ2, γ3, 和 γ4, 对应的是IgG的亚亚型,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 。在小鼠体内这三种亚型为:IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3IgG的亚亚型之间的氨基酸序列非常相似,最大的差异存在于hinge结构,主要是hinge结构的长度,IgG3hingeFc的二倍的长度,在结构上使Fab片段远离Fc片段,IgG2/IgG4hinge结构较短,在结构上使Fab片段远离Fc片段靠的较近。
通常情况下,一个抗体的两条重链和轻链是相同的两条链,但是IgG4在某些情况下可以和其它的IgG4交换重链,产生杂合抗体;杂合抗体的Fc是相似的,但是Fab不相同,因此严格说抗体的两条轻链和重链并不一定完全相同。
IgM
IgM在体内有两种存在形式,在血清中分布的IgM的为分泌型的五聚体,可以高效的触发补体系统;另外,IgM还在B细胞膜以膜结合型的单体形式存在,是B细胞表面用来识别抗原的主要受体;IgMIgG结构上最大区别是,IgM的重链有5Ig结构域,是有一个额外的Ig结构域(CH2)代替了IgGhinge结构。
IgA
在人体内,IgA存在三种可溶的形式,其中单体和小量的二聚体形式存在在血清中,可以通过Fc结构域触发补体系统。第三种类型为分泌型的IgA,由二聚体IgA和分泌片构成(secretory componentSC)起到保护粘膜系统表面的作用,是粘膜免疫的重要构成成员。IgA有两种亚亚型:IgA1IgA2IgA2IgA1hinge结构长,且比较耐受细菌分泌的蛋白酶;另外,IgA是人体中产生数量最多的抗体,一天大约会产生40mg/kg的分泌型IgA,而对应的IgG的产量为30mg/kg
IgE
IgE是单体的分泌型抗体,在血清中的浓度非常的低。IgE能够和mast细胞的Fc受体结合,可以介导人体的过敏反应,跟许多过敏性疾病的发生相关。
IgD
IgDIgM类似,为B细胞表面的结合型抗体,跟B细胞的激活和发育相关。
抗原抗体反应:
1.     可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为:

Ag+Ab→Ag·Ab

抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力,可以用平衡常数K表示:

K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab]

Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性,因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中,特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体,称为亲和层析纯抗体,应用于免疫测定中可得到更好的效果。

2.     最适比例

在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量可绘制成一个曲线。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围,称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩,则无沉淀物形成,在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone),抗原过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时,应使反应系统中有足够的抗体量,否则测得的量会小于实际含量,甚至出现假阴性。

3.     特异性

抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg),随来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。

但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构,在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如:绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成,其结构的不同处在β亚单位,而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体,抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中,如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG,只能用于hCG浓度较高的试验,否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到50 mIu/ml hCG)的实验中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG,以避免与其它激素的交叉反应的发生。

 

4.     敏感性

在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10 μg/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍,达ng/ml水平。例如,用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg,其敏感度可达0.1 ng /ml。

免疫测定在临床检验中的应用:

由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广,在临床检验中可用于测定:

1)  体液中的各种蛋白质,包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。

2)  激素,包括小分子量的甾体激素等。

3)  抗生素和药物。

4)  病原体抗原,HBsAg、HBeAg等。

5)  另外,也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体,例如抗-HBs等。

5.     标记的免疫测定

如上所述,免疫测定是一种很敏感的测定方法,抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度,敏感度可达5~10 μg/ml,但在临床检验中,某些待测物在标本中的含量远低于这一水平,因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记,通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中,标记物分别为放射性核素和酶,最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量,敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中,一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab )检测抗原(Ag)为例,反应式如下:

Ag+ Ab →AgAb+Ab

在反应产物中有与Ag结合的Ab和游离和Ab ,如不将两者分离而测定标记物,测得的结果将为两者之和。因此,游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段,固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上,然后再与标记的抗原或抗体直接反应,结合的标记物被固定在载体上,而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab除去,结合标记物的测定可在固相上进行。

6.    酶免疫测定

酶免疫测定(enzymeimmunoassay)可分为均相(homogenous)和非均相(heterogenous)两种类型。在均相EIA中可不进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下,抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力,因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相EIA在临床检验中较少应用。非均相EIA需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述,固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked immunosorbent assay),简称ELISA,在国内有译作酶联免疫吸附试验的,虽然含义不完全确切,但已习用。

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