免疫组化（IHC）试验说明及详细步骤

免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC）又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术（IHC）是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征。在保持原组织成分、细胞特征以及结构的情况下，IHC利用抗体检测和分析该组织细胞中的蛋白质表达。免疫组织化学是临床病理诊断中常用的技术和手段。从20世纪70年代开始，免疫组化技术就已经应用于病理诊断，对诊断肿瘤、肿瘤分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了人们对于各种疾病及肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断与研究水平。

什么是免疫组化?
在了解免疫组化在临床上的应用之前，我们先来了解下什么是免疫组化。免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异性的抗体，再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法（荧光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究（图1）。

                                         

                                                       图1. The theoretical diagram of IHC
                                                           
免疫组化针对的样本主要是组织。组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。若样本是细胞，通常被称为免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）。对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。

免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)样品处理步骤说明：
          
          

免疫组化（IHC）检测目标：

在选择一抗时，确保其已通过验证可用于免疫组化（IHC）应用。Invitrogen抗体产品含有36,000种经免疫组化（IHC）优化和测试的高质量抗体。一抗有非偶联的（用于间接法）以及偶联的形式用于直接检测或多重检测的方法。二抗也有一系列的偶联形式用于基于比色/发光或染色的免疫组化（IHC）。
每一种抗体都提供即用型的形式：
1.用于免疫组化（IHC）的Invitrogen抗体已有超过21,000次引用
2.具有稳定性能的免疫组化（IHC）实验验证过的抗体
3.在石蜡及冰冻切片中的功能性验证
4.一抗和二抗产品是对其他赛默飞产品在免疫组化（IHC）工作流程（完整工作流程，用于免疫组化的每一步）中的完善补充
5.免疫组化（IHC）抗体来源、仪器、试剂以及技术信息
6.升级后的网站可实现轻松搜索和订购
7. Alexa Fluor及Alexa Fluor Plus偶合物为基于荧光的免疫组化（IHC）提供了众多选择。

免疫组化详细步骤：
确定抗体信息无误，并准备好所需样本切片后，将切片依次放到染色架上，置于200 mL，2%的APES-丙酮溶液中1 min，立即放入烘箱中60℃，15 min，避免脱片。

                
1、脱蜡水化
从烘箱中取出染色架，放入染色盒中脱蜡。

（注：脱蜡时长随温度和脱蜡剂使用次数而定，30min~1h）

将经过脱蜡的染色架取出，沥干，依次放入无水乙醇的染色盒中。
放入3%的H2O2中3min，以消除组织内源性过氧化物酶的活性。
放入pH7.4的PBS中静置。
2、高压抗原修复
高压锅中水浴至100℃，并将染色架放入其中。

（注：缓冲液加热过程中为防止烧杯中进入大量水蒸汽，需将烧杯口用保鲜膜封住）

3、封闭
用10%非免疫山羊血清封闭切片上的组织，置于湿盒中室温静置30min。
4、一抗孵育

将封闭液甩去，加入用1%酪蛋白稀释的一抗，4℃过夜。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤四次。
5、二抗孵育

切片上加入酪蛋白稀释的二抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤四次。
6、三抗孵育

切片的组织上加入酪蛋白稀释的三抗置于湿盒中37℃孵育1h。
将切片置于染色架中，放入PBST中洗涤三次。再放入PBS中洗涤二次。
7、DAB染色
切片的组织上加入DAB染色液，置于湿盒中室温放置10-15 min。

（注意显微镜下观察切片染色情况，染色到深黄且背景无明显着色可进行下一步）
将切片置于染色架中，放入PBS中洗涤二次，每次5min。
8、苏木素染色
切片的组织上加入苏木素染色液，置于湿盒中室温放置30min。
9、脱水封片
将染色架置于清水中洗涤浸泡30min，放入烘箱中烤干。
切片的组织上加入中性树胶，并加上盖玻片。
10、显微镜观察并拍照
选取合适视野进行拍照。