ELISA测定法

                                 ELISA测定法

一、原理
其基本原理可概括为：将特异的抗原-抗体免疫学反应和酶学催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。因此，酶免疫技术一般均有两部分组成，即一次或数次免疫学反应和一次酶促反应。抗原、抗体发生特异结合过程中，设法引入酶结合物，如酶标记的抗抗体，然后加入酶的底物，在酶催化下生成有色产物，反映出被测定抗原或抗体的量。
二、操作流程、类型及特点
1、操作流程：
检测抗体多用间接型elisa。以纯化抗原包被载体，经4℃隔夜，以无关蛋白封闭至少2小时以上，加入待测样品，室温孵育1小时，洗涤干净后加酶标抗体，再经室温孵育、洗涤后，以底物显色，显色到一定程度终止反应，在酶标仪上读结果或以肉眼判断。
2、类型：elisa具体方法的类型繁多，试剂的标准化问题还未最后解决，温育的时间、温度、洗涤液的种类及洗涤次数等都是影响测定的因素。但参考以上基本过程，无论怎样变化，均离不开抗原-抗体反应、酶标抗体的免疫学反应及酶催化作用。
3、特点：(1)、敏感性高，可检出浓度在ug~mg/ml水平；(2)、特异性强；(3)、重复性好；(4)、快速、简便、廉价。
三、实验条件
1、固相载体：可作为固相载体的物质很多，如：纤维素、聚苯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。可以各种形式出现；试管、微量反应板凹孔、小珠等。最常用的是聚苯制品，其吸附性最好。固相包被的机制一般不外乎物理吸附和共价交联，
2、封闭：以无关蛋白占据载体上未被包被的空隙，常用的封闭液是1%牛血清白蛋白或10%小牛血清。
3、待测样品：稀释度要合适，浓度太大会发生非特异性吸附造成假阳性，过分稀释会影响抗原-抗体之间的免疫学反应。选择最适稀释度，在实验体系中取光密度在1.0左右的稀释度为宜。
4、酶结合物：使用高质量的酶结合物是elisa成功的关键。
四、注意事项
酶联免疫技术的试剂标准化问题尚未完全解决，温育过程的时间、温度、洗涤液的种类及洗涤次数都是影响最后测定的因素。为使实验得到满意的结果，在操作过程中应作到
1、每次试验都必须设阳性和阴性对照。
2、封闭要完全。
3、洗涤要测定。